在一次性生產(chǎn)解決方案初次發(fā)布后不久，一次性技術(shù) （SUT）就被行業(yè)接受。從市場(chǎng)的角度來(lái)看，單克隆抗體(mAb)代表了一個(gè)重要的產(chǎn)品類別，該等實(shí)體的生產(chǎn)平臺(tái)具有高度一致性的特點(diǎn)。因此，設(shè)備供應(yīng)商最初專注于開(kāi)發(fā)用于制造該產(chǎn)品組的設(shè)備和相關(guān)一次性組件。因此，設(shè)備供應(yīng)商最初專注于用于生產(chǎn)該產(chǎn)品組的設(shè)備和相關(guān)一次性組的開(kāi)發(fā)。
在過(guò)去十年中，抗體偶聯(lián)物藥物（ADC），在廣義上也稱為生物偶聯(lián)物，采用了一次性制造技術(shù)。這一趨勢(shì)是由產(chǎn)品安全考慮(避免交叉污染)和職業(yè)暴露限制(OEL)要求驅(qū)動(dòng)的。盡管最初在臨床上遇到了挫折，但ADC代表了一個(gè)不斷增長(zhǎng)的細(xì)分市場(chǎng)，有70多種產(chǎn)品處于臨床開(kāi)發(fā)階段，并推出了4種產(chǎn)品，即Kadcyla™（羅氏基因泰克），Adcetris™（西雅圖遺傳學(xué)），Mylotarg™和Besponsa™（輝瑞）。
從作用方式的角度來(lái)看，ADC被認(rèn)為是化療藥物，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合了小分子的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性與mAb的選擇性?？贵w單元特異性地識(shí)別腫瘤抗原，因此，有效載荷可以傳遞到所需的靶標(biāo)。這些有效載荷的全身毒性太高，無(wú)法在沒(méi)有靶向功能的情況下使用。一個(gè)關(guān)鍵的生產(chǎn)步驟是在mAb和高效有效載荷（即活性藥物成分（HPAPI））之間形成共價(jià)化學(xué)鍵，也稱為“彈頭"或“毒素"。常見(jiàn)的有效載荷是美登素類化合物（DM1和DM4），奧利他汀（MMAE和MMAF）和吡咯苯二氮卓類（PBD）衍生物，后者顯示出最高的效力。有效載荷通過(guò)不同復(fù)雜性的連接子與mAb偶聯(lián)。在大多數(shù)情況下，這些連接子與mAb恒定結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸或賴氨酸殘基結(jié)合。半胱氨酸基和賴氨酸基偶聯(lián)示意性地顯示在圖1中。有關(guān)ADC結(jié)構(gòu)和功能方面的更多詳細(xì)信息，我們向感興趣的讀者推薦Hoffmann等人的評(píng)論論文。
除上述ADC外，術(shù)語(yǔ)生物偶聯(lián)物還包括其他化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通常不被歸類為HPAPI，例如：
● 聚合物（例如聚乙二醇、淀粉和聚唾液酸）偶聯(lián)mAb，其中聚合物單元的功能是改變mAb的藥代動(dòng)力學(xué)
● mAb與抗生素偶聯(lián)，可有效靶向治療細(xì)菌感染
● mAb與結(jié)合放射性核素的螯合劑偶聯(lián)，用于向靶向癌細(xì)胞遞送細(xì)胞毒性輻射（放射免疫療法）
● 弱抗原（例如細(xì)菌多糖）與蛋白質(zhì)性質(zhì)的強(qiáng)抗原的結(jié)合疫苗，可引發(fā)針對(duì)弱抗原的更強(qiáng)免疫應(yīng)答
雖然選擇性通常通過(guò)使用完整的單抗來(lái)保證，但該功能可以由工程抗體(如片段抗原結(jié)合(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、單域抗體(sdAb)或另一種抗體模擬支架(affbody、DARPin、anticalin、alphabody等)來(lái)替代。 生物偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，加上ADC的高效能，使得這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成為一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。
2007 年，龍沙是投資專用生物偶聯(lián)設(shè)施的合同制造組織之一，當(dāng)時(shí)的重點(diǎn)是 ADC。在調(diào)試后的 10 年中，該設(shè)施發(fā)布了來(lái)自 30 多種不同產(chǎn)品的 500 多個(gè)臨床和商業(yè)批次。玻璃和不銹鋼多用途設(shè)備用于初始生產(chǎn)，一次性技術(shù)的采用僅限于無(wú)菌過(guò)濾器、轉(zhuǎn)移管、取樣裝置和儲(chǔ)物袋。2014年，推出了一個(gè)一次性的生產(chǎn)平臺(tái)，該平臺(tái)包括 50-200L一次性混合袋技術(shù)和切向流過(guò)濾 （TFF） 撬塊，適用于高達(dá)3 m2 的膜面積。從那時(shí)起，大多數(shù)臨床項(xiàng)目都是在更大規(guī)模的端到端SUT生產(chǎn)設(shè)置中執(zhí)行的。這一發(fā)展是由以下好處推動(dòng)的：
● 降低操作人員接觸有毒化合物的風(fēng)險(xiǎn)
● 避免了每個(gè)HPAPI的生產(chǎn)都需要專用設(shè)備，這在項(xiàng)目周轉(zhuǎn)率高的情況下是一個(gè)重大缺陷
● 由于消除了交叉污染問(wèn)題，縮短了生產(chǎn)中的實(shí)施時(shí)間;從清潔風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估開(kāi)始，擴(kuò)展到執(zhí)行試樣研究、開(kāi)發(fā)特定產(chǎn)品的清潔程序和清潔驗(yàn)證的清潔計(jì)劃已經(jīng)過(guò)時(shí)
● 考慮到ADC的穩(wěn)定增長(zhǎng)正在挑戰(zhàn)現(xiàn)有分析方法的檢測(cè)和量化極限，減少清潔監(jiān)測(cè)的分析工作
● 減少清潔過(guò)程中有毒廢物流的數(shù)量。
本章下一節(jié)將討論使用基于聚合物的生產(chǎn)設(shè)備的缺點(diǎn)，描述ADC制造中一次性解決方案的開(kāi)發(fā)進(jìn)展。
在ADC工藝中使用一次性產(chǎn)品挑戰(zhàn)
有機(jī)溶劑的使用
一個(gè)挑戰(zhàn)是產(chǎn)品接觸表面暴露于有機(jī)溶劑中，這可能會(huì)對(duì)物理穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響，并可能導(dǎo)致可浸出物水平升高。美國(guó)食品和藥物管理局和歐洲藥品管理局的法規(guī)明確規(guī)定，包括一次性使用系統(tǒng)在內(nèi)的加工設(shè)備不應(yīng)對(duì)產(chǎn)品安全和質(zhì)量造成任何危害。典型的親脂性負(fù)載通常溶解在有機(jī)溶劑中，極性非質(zhì)子溶劑如二甲亞砜，二甲基甲酰胺，或二甲基乙酰胺是常用的。另外化學(xué)反應(yīng)通常在含有10-25%有機(jī)溶劑的緩沖水溶液中進(jìn)行，以便在偶聯(lián)步驟中保持小分子的溶解度。隨后的純化步驟應(yīng)設(shè)計(jì)為清洗溶劑、可浸出物、偶聯(lián)試劑（即活化劑）、非偶聯(lián)有效載荷和淬滅劑。與工藝溶液接觸的一次性材料應(yīng)仔細(xì)評(píng)估在所選溶劑濃度和工藝條件下的相容性。Weibing Ding[8]指出了在基于科學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中需要考慮的以下方面：（i）工藝流體和一次性系統(tǒng)之間的化學(xué)相容性，（ii）產(chǎn)品成分，（iii）材料接觸面積，（iv）接觸時(shí)間，（v）工藝溫度，（vi）預(yù)滅菌方法，以及（vii）與最終容器封閉系統(tǒng)的距離。
幸運(yùn)的是，大多數(shù)生物工藝容器和一次性混合袋的產(chǎn)品接觸層由聚乙烯組成，聚乙烯與溶劑含量低于25%的水溶液相容。然而，一次性組件，如由聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯或聚偏二氟乙烯制成的連接器可能對(duì)類似的水溶劑混合物的抵抗力較低，這可能導(dǎo)致化學(xué)品浸出增加，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。此外，與25-100%的溶膠排放含量相關(guān)的問(wèn)題也帶來(lái)了挑戰(zhàn)，這可以通過(guò)在一次性使用模式下使用玻璃瓶和不銹鋼連接器來(lái)解決。
總之，全面的可浸出物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和仔細(xì)選擇一次性使用的設(shè)備組件相結(jié)合，可以將最終產(chǎn)品中的可浸出物濃度降低到可接受的水平。
HPAPI的安全性和處理
ADC生產(chǎn)需要處理具有細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性特征的高效成分。因此，需要特別注意職業(yè)安全和健康以及避免交叉污染。因此，保護(hù)雇員或合同工人不因接觸在制造過(guò)程中處理的化學(xué)品而對(duì)健康產(chǎn)生任何負(fù)面影響是至關(guān)重要的。化工行業(yè)已經(jīng)為化合物（包括藥物中間體和藥物）制定了分類系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于定義OELs，即工作區(qū)域空氣中定義的化學(xué)品的最大可接受濃度。隨著時(shí)間的推移，建議的分類系統(tǒng)已經(jīng)演變成SafeBridge標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)有四個(gè)類別。用于ADC生產(chǎn)的化學(xué)品的典型OELs范圍在100到1ng/m3之間。
在工人保護(hù)和職業(yè)健康方面的圣杯是“封閉式制造"，與固定不銹鋼管道互連的不銹鋼設(shè)備是封閉式生產(chǎn)的經(jīng)典解決方案。然而，近年來(lái)，我們已經(jīng)能夠證明，從職業(yè)安全和交叉污染控制的角度來(lái)看，商用一次性設(shè)備是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，并且可以得出結(jié)論，一次性工藝解決方案非常適合封閉、無(wú)菌的處理。所選溶液工作可靠，能夠承受偶聯(lián)過(guò)程所需的相當(dāng)溫和的反應(yīng)條件（溫度、壓力和溶劑濃度），因?yàn)楦吒g性的工藝條件也對(duì)mAb有害。
許多公司細(xì)分為六個(gè)產(chǎn)品類別（安全橋1和2為三個(gè)類別，安全橋3和4為3類）。這允許工作標(biāo)準(zhǔn)定義具有更高的粒度。下表總結(jié)了中概述的信息。
用萘普生模擬典型接合過(guò)程的替代研究經(jīng)常進(jìn)行，以驗(yàn)證遏制。生產(chǎn)區(qū)域的表面拭子和空氣中顆粒的監(jiān)測(cè)為生產(chǎn)設(shè)備和設(shè)施的適用性提供了證據(jù)。
關(guān)鍵單元操作
1 攪拌罐中的反應(yīng)
除了轉(zhuǎn)移，在生產(chǎn)生物偶聯(lián)物時(shí)需要考慮的關(guān)鍵單元操作是攪拌槽、TFF、柱層析、在線過(guò)濾和凍融循環(huán)中的反應(yīng)。
傳統(tǒng)的生物制藥生產(chǎn)主要使用一次性的攪拌槽來(lái)保持中間產(chǎn)品溶液的均勻性，而生物偶聯(lián)物的生產(chǎn)涉及在一次性攪拌槽中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。這些例子包括（i）mAb的還原（半胱氨酸偶聯(lián)），（ii）選擇性再氧化，以及（iii）連接子有效載荷與mAb的偶聯(lián)。對(duì)于某些試劑添加步驟，所得反應(yīng)溶液的快速均質(zhì)化對(duì)于獲得所需的產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性以及獲得多個(gè)批次的可重現(xiàn)產(chǎn)品曲線至關(guān)重要。由于試劑可充注于有機(jī)溶劑中，因此一次性設(shè)備應(yīng)保證在適當(dāng)短的時(shí)間范圍內(nèi)將水相和有機(jī)相混合到均勻的溶液中。
2 切向流過(guò)濾
在ADC生產(chǎn)中，TFF用于（i）清除溶劑，（ii）去除小分子反應(yīng)物，如氧化劑和還原劑或過(guò)量的連接子有效載荷，（iii）緩沖液的交換，（iv）（中間）產(chǎn)物的濃度。根據(jù)藥物特性和目標(biāo)藥物濃度，產(chǎn)品溶液可能變得非常粘稠。在我們的設(shè)施中引入端到端一次性生產(chǎn)ADC時(shí)，市售TFF設(shè)備和相關(guān)流量組的設(shè)計(jì)只能承受2.5 bar（g）的壓力。因此，龍沙團(tuán)隊(duì)不得不重新設(shè)計(jì)和調(diào)整流量組，以抵抗更高的壓力。重新設(shè)計(jì)的一次性 TFF 歧管可在高達(dá) 4 bar（g） 的進(jìn)料壓力下運(yùn)行。最初可用的 1/2“ TFF 撬塊僅限于 3 m2 膜面積，這將批量大小限制為 100-200 g 蛋白質(zhì)。最近推出的 1“ 一次性 TFF 撬塊可容納高達(dá) 10 m2 的膜面積，典型批量大小可達(dá) 1 kg，從而擴(kuò)大了 SUT 在 ADC 制造中的應(yīng)用范圍。使用后處理與產(chǎn)品接觸的材料（包括膜和歧管）大大減少了處理受污染設(shè)備所需的時(shí)間，并將清潔過(guò)程中產(chǎn)生的有毒廢物和需要特定處理的廢物的數(shù)量降低。
3 色譜法
雖然早期的ADC產(chǎn)品避免了色譜步驟，但臨床開(kāi)發(fā)中許多產(chǎn)品的過(guò)程包括精純步驟，通常用于去除大分子產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。從操作的角度來(lái)看，最好使用預(yù)填充柱，因?yàn)檫@些可以在不打開(kāi)的情況下處理，從而避免操作員接觸高效化合物，這種風(fēng)險(xiǎn)在多用途色譜柱的拆包過(guò)程中特別高。
4 過(guò)濾和轉(zhuǎn)移
在生物制藥生產(chǎn)的情況下，0.2毫米過(guò)濾操作基本上服務(wù)于生物負(fù)荷控制的目的。深度過(guò)濾偶爾用于去除加工過(guò)程中形成的骨料。蠕動(dòng)泵與生物丁橡膠管相結(jié)合，適用于標(biāo)準(zhǔn)輸送和過(guò)濾步驟。由于其接觸面積大，工藝過(guò)濾器在可提取物和可浸出物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中需要高度關(guān)注。
5 原液凍融
根據(jù)藥品生產(chǎn)場(chǎng)所的工藝量和能力，生物偶聯(lián)原料藥(BDS)在-20℃或-65℃以下冷凍和儲(chǔ)存之前被釋放到冷凍容器、二維 (2D) 袋、大瓶或瓶子中。從操作角度來(lái)看，冷凍容器和袋子比瓶裝解決方案更受青睞，因?yàn)樗鼈兛梢赃M(jìn)行密閉分裝，而無(wú)需“A 級(jí)"潔凈室環(huán)境。
使用2D袋作為5-20升體積的冷凍容器已經(jīng)變得非常流行。其原因是（i）溶液的一次性使用性質(zhì)，（ii）使用配備無(wú)菌連接器和斷開(kāi)器的歧管的封閉分裝能力，（iii）提高可擴(kuò)展性，（iv）開(kāi)發(fā)用于安全運(yùn)輸?shù)谋Ｗo(hù)殼，（v）對(duì)低溫濃縮效應(yīng)和袋子儲(chǔ)存的良好控制，以及（vi）更高的冷藏室儲(chǔ)存密度。上述保護(hù)殼的開(kāi)發(fā)有助于克服諸如在低于-65°C的溫度下袋脆性增加等弱點(diǎn)。需要考慮聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以及端口和管道在運(yùn)輸過(guò)程中承受機(jī)械應(yīng)力的情況。另一個(gè)可取的特點(diǎn)是與凍融設(shè)備解決方案的連接性和靈活性，例如板式凍融裝置和靜態(tài)或具有主動(dòng)空氣再循環(huán)的鼓風(fēng)冷凍機(jī)，以避免投資購(gòu)買(mǎi)額外的設(shè)備。由于凍融速度會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此控制凍融的趨勢(shì)也很明顯。
半胱氨酸偶聯(lián)過(guò)程–ADC生產(chǎn)工藝案例研究
半胱氨酸偶聯(lián)過(guò)程在龍沙ADC設(shè)施中的一次性設(shè)備中端到端運(yùn)行，每批提供數(shù)百克ADC。這種一次性的生產(chǎn)設(shè)置使內(nèi)毒素控制到某些治療適應(yīng)癥所需的非常低的濃度。偶聯(lián)和滲濾步驟在一次性混合袋中進(jìn)行，混合袋的處理體積在 10 至 200 L之間，含有 200g API。
該過(guò)程從使用還原劑解凍和還原mAb開(kāi)始；常用的還原劑是三（2-羧乙基）膦（TCEP）的水溶液，可將mAb的分子間二硫鍵還原為兩個(gè)硫醇基團(tuán)。標(biāo)準(zhǔn)的一次性混合袋非常適合此操作。第一代半胱氨酸偶聯(lián)過(guò)程直接進(jìn)入偶聯(lián)步驟，這通常導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)分布的藥物抗體比（DAR）為0-8。ADC藥物具有特定的平均DAR，通常在2-4范圍內(nèi).如表4.所示，第二代半胱氨酸與工程抗體的偶聯(lián)過(guò)程引入了選擇性再氧化步驟（通常使用脫羥基抗壞血酸），該步驟只保留選定的硫醇功能，并恢復(fù)mAb中確定位置的二硫鍵。這種還原后選擇性再氧化的過(guò)程是位點(diǎn)選擇性結(jié)合的先決條件。在偶聯(lián)步驟之后，這導(dǎo)致具有相同兩個(gè)硫醇偶聯(lián)且DAR為2的單產(chǎn)物物種。 在選擇性再氧化之前，過(guò)量的還原劑通過(guò)在單次使用的TFF設(shè)備中進(jìn)行透析過(guò)濾來(lái)去除。然后對(duì)還原的mAb進(jìn)行選擇性再氧化。
在下一步中，mAb中剩余的硫醇功能與一定量的連接子有效載荷分子偶聯(lián)，并在反應(yīng)完成后淬滅過(guò)量的藥物連接子（N-乙酰半胱氨酸已被確定為合適的淬滅試劑）。然后在TFF操作或隨后的精純色譜步驟中清除工藝雜質(zhì)。后者使用預(yù)填充柱在一次性色譜撬塊上運(yùn)行，以提供數(shù)百升規(guī)模的高純度產(chǎn)品。在ADC生產(chǎn)中使用預(yù)填充柱與一次性設(shè)備結(jié)合使用被證明特別有益，因?yàn)椋?/span>
● 對(duì)色譜柱填料和拆包設(shè)備沒(méi)有要求
● 節(jié)省了包裝和拆包色譜柱的時(shí)間;色譜柱還可以在一次性模式下靈活使用，也可以清潔和儲(chǔ)存以進(jìn)行多次使用和
● 職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)降低；HAPI污染樹(shù)脂的開(kāi)放式處理需要采取重大的密閉措施，以確保操作人員的安全并控制交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。
然后，精純步驟的產(chǎn)品池通常以10-20倍的倍數(shù)濃縮至通常超過(guò)10克/升的目標(biāo)濃度?？紤]到高濃度因素，還應(yīng)將設(shè)備滯留因素考慮在內(nèi)。此外，小分子偶聯(lián)伴侶的高濃度和特性會(huì)影響粘度。
濃縮產(chǎn)品最終配制成BDS，過(guò)濾并填充到PETG瓶或2-D袋中，冷凍至-20°C以下或-65°C以下。 必須注意避免低溫濃縮效應(yīng)，這可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。
總結(jié)和結(jié)論
ADC和其他生物偶聯(lián)物的生產(chǎn)要求嚴(yán)格，以確保產(chǎn)品質(zhì)量和安全的工作條件。此外，有機(jī)合成與生物加工中更常用的技術(shù)相結(jié)合是相當(dāng)不尋常的。然而，正是與生物工藝的接近鼓勵(lì)了利用SUT制造ADC。許多優(yōu)點(diǎn)包括改善職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)狀況，降低投資成本，特別是臨床生產(chǎn)方面，顯著降低交叉污染問(wèn)題，以及大大減少清潔過(guò)程中的有毒廢物流。與不銹鋼設(shè)備生產(chǎn)相比，使用聚合物基接觸材料的一個(gè)缺點(diǎn)是可浸出物風(fēng)險(xiǎn)增加。然而，正如許多活動(dòng)所證明的那樣，這種風(fēng)險(xiǎn)可以通過(guò)可浸出物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和細(xì)致地選擇一次性生產(chǎn)解決方案來(lái)管理。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，SUT在ADC生產(chǎn)中的利用率在安全性、設(shè)備功能和總體項(xiàng)目成本方面是相當(dāng)或更優(yōu)。 如本文所示，如今可以使用一次性設(shè)備成功生產(chǎn)ADC?，F(xiàn)有的規(guī)模限制將逐步克服，結(jié)合一次性設(shè)備方面的進(jìn)展，將確認(rèn)SUT進(jìn)一步應(yīng)用的趨勢(shì)。此外，目前用于ADC生產(chǎn)的技術(shù)解決方案可能為在化學(xué)制造的其他領(lǐng)域?qū)嵤┮淮涡栽O(shè)備鋪平道路。
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